| (72) | Inventeur(s) : ARMANI, Elisabetta ; AMARI, Gabriele ; LINNEY, Ian ; CAPALDI, Carmelida ; BLACKABY, Wesley ; VAN DE PÖEL, Hervé ; BAKER-GLENN, Charles ; TRIVEDI, Naimisha |
| (57) | Abrégé : L'invention concerne de nouveaux composés qui sont à la fois des inhibiteurs de l'enzyme phosphodiestérase 4 (PDE4) et des antagonistes du récepteur muscarinique M3, des procédés de préparation de tels composés, des compositions les contenant et leur utilisation thérapeutique. Dosage de Binging M3: des cellules de clones CHO-KI exprimant le récepteur M3 humain (Swissprot P20309) ont été récoltées dans une solution saline tamponnée au phosphate sans Ca ++ / Mg ++ et recueillies par centrifugation à 1500 tr / min pendant 3 min. Les pastilles ont été remises en suspension dans du tampon A glacé (Tris-HCl 15 mM pH 7,4, MgCl2 2 mM, EDTA 0,3 mM, EGTA 1 mM) et homogénéisées par un politron PBI (réglage 5 pendant 15 s). La fraction membranaire brute a été recueillie par deux étapes de centrifugation consécutives à 40000 g pendant 20 min à 4 ° C, séparées par une étape de lavage dans le tampon A. Les pastilles obtenues ont finalement été remises en suspension dans du tampon B (Tris HCl 75 mM, pH 7,4, 12,5 mM). MgCl2, EDTA 0,3 mM, EGTA 1 mM, saccharose 250 mM) et des aliquotes ont été stockés à - 80 ° C. Le jour de l'expérience, les membranes congelées ont été remises en suspension dans du tampon C (Tris-HCl 50 mM, pH 7,4, MgCb 2,5 mM, EDTA 1 mM). Le ligand radioélectrique muscarinique non sélectif [3H] -N-méthyl scopolamine (Mol. Pharmacol.45: 899-907) a été utilisé pour marquer les sites de liaison à M3. Les expériences de liaison ont été effectuées en double (courbes de concentration en dix points) dans des plaques à 96 puits à une concentration de radioligand de 0,1-0,3 nM. La liaison non spécifique a été déterminée en présence de N-méthyl scopolamine à froid 10 uM. Les échantillons (volume final 0,75 ml) ont été incubés à la température ambiante pendant 90 minutes. La réaction a été arrêtée par filtration rapide à travers des plaques Unifilter GF / B et deux lavages (0,75 ml) avec du tampon froid C en utilisant un Harvester Filtermate Harvester. La radioactivité sur les filtres a été mesurée par un compteur à scintillation de microplaques TriCarb 2500 (PerkinElmer). Des composés représentatifs de l'invention, lorsqu'ils ont été testés dans l'un des protocoles mentionnés ci-dessus, ont présenté une IC50 inférieure à 100 nM. Des composés représentatifs de l'invention présentaient une IC50 inférieure à 100 nM à la fois dans les dosages sans cellules PDE4 et dans les taux de liaison à M3. |
